只有正确的诊断才能制定正确的治疗方案，因此结肠癌的诊断是非常重要的。然而由于很多疾病都有相似的症状，所以要做好鉴别诊断，直肠癌往往被误诊为痔疮、细菌性痢疾、慢性结肠炎等，误诊率高达60%至80%，其主要原因是没有进行必要的检查，特别是肛门指诊和直肠镜检查。阑尾周围脓肿可被误诊为盲肠癌，但是本病血象中白细胞及中性粒细胞增高、无贫血、消瘦等恶病质，做钡灌肠检查可明确诊断。
结肠癌的鉴别诊断，主要还有结肠炎性疾病如肠结核、血吸虫病、肉芽肿、阿米巴肉芽肿、溃疡性结肠炎以及结肠息肉病等。临床上鉴别要点是病期的长短、粪便检查寄生虫、钡灌肠检查所见病变形态和范围等，最可靠的鉴别是通过结肠镜取活检组织检查，在肛肠转诊过程中通过指诊发现直肠黏膜外肿块是比较常见的事，由于黏膜外肿块不像直肠癌那样直观，良恶性一时难以鉴别，因此常易误诊。
直肠粘膜外肿块，其起源复杂，可来自于粘膜外肠壁组织或肠外组织，结肠其他肿瘤如结肠直肠类癌，瘤体小时无症状，瘤体长大时可破溃，出现极似结肠腺癌的症状，原发于结肠癌的恶性淋巴瘤，病态形态呈多样化与结肠癌常不易区别，均应做细胞涂片活检来鉴别。
因此全面的询问病史、正确的选择检查手段是非常重要的。