原发性局灶性节段性肾小球硬化鉴别诊断应包括以下几个方面。在病因上应尽可能的寻找继发性的因素，在临床上还应尽可能的明确家族史。对于家族中具有相同或类似的患者，应考虑遗传性的局灶性节段性肾小球硬化。因为在遗传性局灶性节段性肾小球硬化中存在常染色体隐性遗传以及极少数的不外显的显性遗传，但遗传病史难以将其从原发性局灶性节段性肾小球硬化中鉴别出来，也是目前难以回避的现实性问题。
但是，对于疗效不好的原发性局灶性节段性肾小球硬化患者，在条件许可时，应筛查其突变基因。此外，部分病理类型的IgA肾病在光镜检查中也可表现为类似局灶节段性肾小球硬化的病理改变，但是其临床表现与治疗反应与原发性局灶节段性肾小球硬化有较大差别。目前并不建议归为局灶节段性肾小球硬化的范畴。最后，由于本病的局灶节段特点，在肾活检或病理切片时未取到节段性硬化的肾小球而误认为微小病变肾病或轻度系膜增生性肾小球肾炎。
以下情况时应高度怀疑局灶节段肾小球硬化的鉴别：一、初步诊断为微小病变肾病或轻度系膜增生性肾小球肾炎的肾病综合征患者，如果经糖皮质激素治疗无效。
二、以蛋白尿为主要临床表现的原发性肾小球疾病，虽光镜下肾小球的病变轻微，但肾小球体积增大，或存在球囊粘连、局灶性小管的萎缩、肾间质纤维化。
三、在电镜下，见到足突与肾小球基底膜分离，或在患者尿中找到脱落的足细胞。在出现上述这些情况时，肾组织标本应增加连续切片，必要时需要重复肾活检。