低血糖综合征的诊断可以通过多次监测空腹血糖，如果多次空腹血糖的水平低于3.36mmol/L，则应该高度注意该患者存在低血糖综合征。还可以通过葡萄糖耐量试验，低血糖患者及胰岛素瘤的患者，多呈现为低血糖曲线，偶有正常值，仅在发作时才有低血糖发生。
也可以通过血清胰岛素及c肽测定来检查，还可以通过进食试验来确定，禁食24小时血糖下降，出现低血糖的症状；通过脑电图检查也有助于该病的诊断，长期低血糖患者会出现脑电图的慢波或其他异常波的改变。
也可以通过远端肌肉去神经表现的肌电图来表现患者的诊断，其诊断还可以通过发作时成人与儿童血糖水平低于2.24到2.8mmol/L来确诊，新生儿低于1.68mmol/L也可以确诊。