手足口病化验血能确诊，但有窗口期，仅限于疾病的急性期和恢复期。此两期血清柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型等肠道病毒中和抗体有4倍以上的升高，是确诊手足口的重要依据。
重症病例可伴有血常规或血生化的异常，血常规可见白细胞计数明显升高，血生化可见谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白和血糖的升高。
临床常规确诊常选择鼻咽拭子、气道分泌物、疱疹液或粪便标本等，具有操作相对简单、方便，且检查病毒阳性率高等优点。