对于神经莱姆病诊断最为重要的依据是流行病学、脑脊液检查和特异的血清学诊断实验。
神经莱姆病是一种人畜共患的疾病，一般的辅助检查例如头颅影像学检查、腰部穿刺等，并没有特异性，容易误诊为其它神经系统疾病，尤其是在疾病非流行高发的地区，不能完全依靠流行病学或者是皮肤的损害来确诊，血清学检查对神经莱姆病诊断有特异性，对临床诊断和病情的监测有重要的价值。
可以通过间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验，测定血清抗伯氏疏螺旋体抗体，从患者的病灶、血液、脑脊液检出病原体是最可靠的诊断依据。