支原体感染的诊断有赖于呼吸道标本培养，但技术要求较高，需要时间三周，临床很少应用。
PCR检测支原体DNA敏感性和特异性均较高，可用于早期诊断，但尚未批准用于临床。血清学在肺炎支原体感染实验室诊断中，具有重要的意义，尤其是在不能进行培养和PCR尚未常规应用于临床检验项目的情况下。
首次感染肺炎支原体，抗体在3到6周达到高峰,持续数月或数年后逐渐下降。对于血清冷凝集试验，大于等于1比40或血清抗体检测急性期和恢复期抗体滴度呈4倍以上增长时，可以诊断为支原体感染。