环磷酰胺是一种广谱抗肿瘤药物，对白血病和实体瘤都有效。作为抗肿瘤药物，可用于淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、尤因肉瘤、软组织肉瘤以及急性白血病和慢性淋巴细胞白血病的治疗。对睾丸肿瘤、头颈部鳞癌、鼻咽癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤也有一定的疗效，目前多与其他抗癌药组成联合化疗方案。此外，环磷酰胺还可以作为免疫抑制剂。
用于各种自身免疫性疾病，如严重的类风湿性的关节炎、全身性红斑狼疮、儿童肾病综合征、多发性的肉芽肿、天疱疮以及溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜等。也可用于器官移植时的抗排斥反应，通常与泼尼松、抗淋巴细胞球蛋白合用。还可以作为眼科用药，环磷酰胺滴眼液可用于翼状胬肉术后、角膜移植术后蚕食性角膜溃疡等。临床上环磷酰胺可以口服或静脉给药，不良反应主要包括骨髓抑制、脱发、消化道不良反应、口腔炎、膀胱炎等。罕见状况下，还可以发生肺炎、心肌损伤及肾毒性等。