肛门闭锁的鉴别的目的主要是为了诊断肛门闭锁，同时以区别与肛门闭锁有可能会引起混淆的疾病。因为肛门闭锁是属于肛门直肠先天性畸形，在鉴别上最主要就是需要与异位肛门进行鉴别。异位肛门的特点为：异位肛门的解剖位置较正常肛门有一定改变，明确异位肛门的诊断主要是依据肛门视诊、到立位腹部侧位x线平片、B超磁共振检查可以得到确诊。
而为了更好的诊断肛门闭锁通常依据症状体征，一般不难做出诊断，但是还需要结合影像学检查等辅助手段以确定直肠闭锁的高度、直肠末端与耻骨直肠肌的关系以及有无泌尿系瘘，常用的检查包括X线检查、瘘管造影、B超检查、CT及磁共振检查。