首先，可以做钡剂灌肠，典型的先天性巨结肠灌肠，可以清楚的显示出其狭窄、隐形和扩张段。24小时复查腹部平片仍有大量的背景滞留。
第二个，乙酰胆碱酯酶染色。先天性巨结肠的特征之一，就是无神经节细胞、长段副副交感神经大量增生。产生的神经纤维呢，位于粘膜固有层和粘膜基层。然后能出现乙酰胆碱酯酶阳性。
第三个，肛门直肠测压。就是像直肠内气囊注入大量的气体。然后他没有直肠肛门一直反射。在新生儿，由于肌间神经丛发育的不够成熟或者说刚刚建立起反射尚不稳定，所以说，因此要慎用。
第四个，直肠粘膜吸引活检。从直肠壁吸引粘膜和粘膜下基层活检，期间，神经节细胞缺如即可诊断。对新生儿较为可靠。
第五个，直肠全层活检，理论上是金标准，需要在麻醉下进行。